傅里葉光場顯微成像技術(shù)—2D顯微鏡實現(xiàn)3D成像

摘要：近年來，光場顯微技術(shù)的應(yīng)用越來越廣泛，針對光場顯微鏡的改進和優(yōu)化也不斷出現(xiàn)。目前市場的2D顯微鏡比比皆是，如何在其基礎(chǔ)上實現(xiàn)三維成像一直是成像領(lǐng)域的熱門話題，本次主要討論3D成像數(shù)字成像相機的研究，即3D光場顯微鏡成像技術(shù)，隨著國內(nèi)外學者通過研究提出了各種光場顯微鏡的改進模型，將分辨率、放大倍數(shù)等重要參量進行了顯著優(yōu)化，大大擴展了光場顯微技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域。同時，由于近年來微型化集成技術(shù)的發(fā)展，微型化光場顯微技術(shù)也逐漸成為國內(nèi)外學者研究的熱點。

1. 傅里葉光場顯微成像技術(shù)在國內(nèi)外的發(fā)展

2014年，Rober等人在核熒光顯微鏡的像平面上放置了一個微透鏡陣列，構(gòu)建了一個光場反卷積顯微鏡(LFDM)裝置，如圖1所示。為了克服LFM中軸向和橫向空間分辨率之間的權(quán)衡，研究團隊通過利用記錄數(shù)據(jù)的混疊并使用適用于LFM的3D反卷積算法，有效地獲得了改進的橫向和軸向分辨率，蕞終在生物樣品內(nèi)部的橫向和軸向維度上，分別實現(xiàn)了高達約1.4μm和2.6μm的有效分辨率。

圖1

2019年，我國的學者團隊通過改變微透鏡陣列與透鏡和圖像傳感器之間的相對位置，使微透鏡陣列遠離了光學系統(tǒng)的本征像面，第1次提出了高分辨率光場顯微鏡（HR-LFM）概念，有效避免了傳統(tǒng)光場顯微鏡產(chǎn)生的重建偽影。同時由于微透鏡陣列的移動，圖像傳感器不再記錄原始像平面處的圖像混疊，大大提高了成像分辨率，如圖2所示。

圖2

這一裝置廣泛應(yīng)用于活體細胞成像，三維分辨率為300nm-700nm，成像深度為幾微米，體積采集時間為毫秒級。該方法可以將線性調(diào)頻作為一種特別有用的工具，在多個時空水平上理解生物系統(tǒng)。此后隨著光場顯微技術(shù)的快速發(fā)展，光場顯微鏡產(chǎn)生了更多類型的演變，如圖1-7所示。研究人員通過在微型顯微鏡平臺上引入光場顯微鏡（LFM），構(gòu)建了微型化光場顯微鏡（MiniLFM），證明了單次掃描體積重建，如圖3所示。這是通過將微透鏡陣列（MLA）與光場反褶積算法相結(jié)合，將微透鏡陣列（MLA）引入到現(xiàn)有的微型鏡平臺上。然而，這種設(shè)計在多個深度上存在橫向分辨率不均勻的問題。

圖3

2. 微型化集成技術(shù)的發(fā)展

光學顯微鏡是一種在很大程度上抵制集成的技術(shù)，它通常仍然是一種體積龐大、價格昂貴的桌面儀器。在神經(jīng)科學中，顯微技術(shù)在活體動物身上得到了廣泛的應(yīng)用，但是傳統(tǒng)顯微鏡的局限性阻礙了腦成像實驗的范圍和規(guī)模。2011年，KunalKGhosh等人第1次提出了光場熒光顯微鏡的微型化集成，如圖4所示。

這是一種微型集成熒光顯微鏡，由大量可生產(chǎn)部件制成，包括半導體光源和傳感器。該設(shè)備能夠在活躍的老鼠身上進行0.5mm3的高速細胞成像。與高分辨率光纖顯微鏡相比，這一設(shè)備在光學靈敏度、視野、分辨率、成本和便攜性方面具有優(yōu)勢。

圖4

傳統(tǒng)的光場顯微鏡（LFM）同時捕獲入射光的二維空間和二維角度信息，能夠通過單個相機計算重建樣本的完整三維體積信息，如圖5所示。對于傳統(tǒng)的線性調(diào)頻，將微透鏡陣列（MLA）放置在寬視場顯微鏡的本征像面（NIP）上，并且光學信號以混疊方式記錄在MLA后焦平面的微透鏡上，但線性調(diào)頻的空間信息采樣模式是不均勻的，導致了重建偽影的出現(xiàn)。除此之外，體積重建采用波光學模型的PSF反褶積。傳統(tǒng)線性調(diào)頻的PSF在橫向和軸向尺寸上都是空間變化的，這增加了計算成本，使得重建相當慢，不利于快速觀察動態(tài)或功能數(shù)據(jù)。

圖5

傅里葉光場顯微鏡通過在透鏡和微透鏡陣列之間插入一個新的光學透鏡，第1次將光學變換從時域轉(zhuǎn)入傅里葉域（FD），如圖6所示。在傅里葉頻域光學系統(tǒng)中，所有信號都可以看做不同正弦函數(shù)的疊加，因此這一光學透鏡的引入可以將入射光波變成不同頻率的單色平面波的線性組合，由于不同單色平面光具有不同的系數(shù)，即復振幅，因此后焦面上不同坐標的光強分布，對應(yīng)入射光波分解成的不同頻率單色光波的功率，即位置坐標和光的頻率是一一對應(yīng)的。來自中繼像面處圖像的光場被傅里葉透鏡轉(zhuǎn)換為傅里葉頻域下的光場，并與物鏡后瞳孔波前共軛，微透鏡陣列通過對波前分段，在單個透鏡后傳輸角度信息，從而使相機在不同區(qū)域輸出圖像。

圖6

傅里葉光場系統(tǒng)通過在傅里葉域（FD）中記錄4D光場，成像方案主要通過兩種方式對LFM進行變換。首先，F(xiàn)D系統(tǒng)允許以一致的混疊方式分配入射光的空間和角度信息，有效地避免由于冗余而產(chǎn)生的任何偽影。第二，由于FD以并行方式處理信號，因此可以用統(tǒng)一的三維點擴展函數(shù)來描述圖像形成，從而大大減少了計算成本。

3. 光場傳播和成像模型

結(jié)合光場顯微技術(shù)和傅里葉變換理論的有關(guān)知識，微型化傅里葉光場顯微鏡的設(shè)計是在光場顯微鏡的基礎(chǔ)上引入一個新的光學透鏡，這一透鏡放置的位置應(yīng)遠離像平面NIP處，同時應(yīng)放置在主透鏡和微透鏡陣列之前；根據(jù)微型化的實際需要，本次選用的物鏡系統(tǒng)是折射率呈梯度變化的自聚焦透鏡GRINlens。由此可以初步得出微型化傅里葉光學系統(tǒng)的主要光學結(jié)構(gòu)如圖7所示，這也是光場傳播和成像的主要路徑。

圖7

4. 光路設(shè)計

傅里葉光場顯微鏡是在改進后的高分辨率光場顯微鏡的基礎(chǔ)上，在透鏡和微透鏡陣列之間插入一個新的透鏡，該透鏡能將光場從時域轉(zhuǎn)換成頻域，起到傅里葉變換的作用。為了實現(xiàn)微型化，物鏡系統(tǒng)采用GRINlens實現(xiàn)，具體的光路原理圖如圖8所示。

圖8

5. 機械系統(tǒng)整體結(jié)構(gòu)設(shè)計

本設(shè)計的光學外殼是基于傅里葉光場顯微鏡的微型化而產(chǎn)生的。隨著微型化集成技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的學者團隊開始研究將光場顯微技術(shù)與微型化技術(shù)進行結(jié)合，也由此設(shè)計出了適用于不同光路的微型化結(jié)構(gòu)模型。如圖9所示，一學者團隊利用GRINLENS作為物鏡系統(tǒng)，設(shè)計完成了一般光學顯微鏡和光場顯微鏡的微型化結(jié)構(gòu)。通過調(diào)整各元器件的相對位置，盡可能壓縮整個微型化外殼的尺寸，在微型化的同時實現(xiàn)光路設(shè)計的預(yù)期功能。

圖9

基于這一研究成果，根據(jù)所設(shè)計的微型化傅里葉光場顯微鏡，在原有光場顯微鏡微型化外殼的基礎(chǔ)上，加入一個新的凹槽，用來安放新加入的傅里葉透鏡。結(jié)合前文設(shè)計好的各元器件的尺寸參數(shù)和相對位置，結(jié)合光路預(yù)期實現(xiàn)的功能，蕞終設(shè)計并完成了微型化傅里葉系統(tǒng)的光學外殼結(jié)構(gòu)，具體尺寸及結(jié)構(gòu)如圖10所示。

圖10

圖11

6. 總結(jié)

15年來，人們一直提出實施光場顯微鏡（也稱為全透視或整體顯微鏡）。光場顯微鏡能夠記錄厚樣品的3D信息，而無需執(zhí)行多次拍攝。通過捕獲不同的視角并使用適當?shù)乃惴?，可以進行深度重建（關(guān)注不同的平面）并計算樣品寬度和長度上可區(qū)分部分的深度圖。隨著該技術(shù)進一步的拓展，應(yīng)用已逐漸走向大眾并實現(xiàn)產(chǎn)品化，比如上海昊量光電代理的西班牙的DOIT 3D Micro相機如圖11所示，DOIT®（數(shù)字光學成像技術(shù)）基于全能信息捕獲的范式轉(zhuǎn)變。它設(shè)計不是在圖像平面附近捕獲信息（傳統(tǒng)技術(shù)可以這樣做），而是在傅里葉平面中捕獲信息。通過這種方式，可以直接獲得正交透視，而無需任何數(shù)字處理。此外，還避免了使用小微透鏡的要求，這避免了限制傳統(tǒng)全透鏡模式分辨率的波粒二象性，通過zui簡單的方法讓2D顯微鏡實現(xiàn)3D成像如圖12所示。

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